干細(xì)胞療法治療糖尿?。哼M(jìn)展與挑戰(zhàn)

一個(gè)世紀(jì)以前，1型糖尿病意味著死刑?，F(xiàn)在，它只是日常病。著名國(guó)際期刊《Cell Stem Cell》刊登了一篇綜述，這篇綜述闡述了干細(xì)胞治療糖尿病的關(guān)鍵技術(shù)和核心問(wèn)題。文章從如何生成功能完整的胰島，胰島細(xì)胞移植中存在的免疫問(wèn)題，再到干細(xì)胞微囊化的未來(lái)方向與策略。是一篇值得學(xué)習(xí)的好文章。

干細(xì)胞與糖尿病

近一個(gè)世紀(jì)以來(lái)，重組胰島素合成和給藥方式的進(jìn)步從根本上降低了糖尿病相關(guān)疾病的發(fā)病率和死亡率。盡管如此，全世界仍有4億的病人因糖尿病并發(fā)癥而遭受著致命的影響，如糖尿病腎病、眼病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。嚴(yán)格的飲食控制，可以減緩或預(yù)防I、II型糖尿病并發(fā)癥的發(fā)展。遺憾的是，這種嚴(yán)格的飲食控制也會(huì)引起低脂血癥，因而措施的實(shí)施也受病人狀況的限制。通過(guò)實(shí)體胰腺器官移植或胰島移植的方法來(lái)替代β細(xì)胞，都可以達(dá)到不使用胰島素而使病情獲得良好控制的目的。由于胰島組織的來(lái)源有限，因此，用干細(xì)胞生產(chǎn)出充足的分泌胰島素的細(xì)胞資源，將可以滿(mǎn)足β細(xì)胞替換、達(dá)到胰島素非依賴(lài)的廣泛需求。 

干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，組織工程的進(jìn)步再加上生物材料的發(fā)展，使得其離臨床轉(zhuǎn)化越來(lái)越近，成為最有潛力的糖尿病替代治療策略。然而，干細(xì)胞治療糖尿病關(guān)鍵技術(shù)和核心問(wèn)題仍有待深入研究和克服。

如何生成功能完整的胰島

近十余年，用人源干細(xì)胞生產(chǎn)功能性β細(xì)胞取得了顯著的進(jìn)展?；静呗允侵匮萘伺咛r(shí)期多能干細(xì)胞分化的主要路徑：形成明確的內(nèi)胚層，然后胰腺內(nèi)胚層，再到內(nèi)分泌前體細(xì)胞（祖細(xì)胞）并最終形成胰島細(xì)胞。最近的研究重點(diǎn)在生產(chǎn)對(duì)葡萄糖刺激產(chǎn)生響應(yīng)并分泌胰島素的單個(gè)細(xì)胞上。幾個(gè)研究室的精力集中在生產(chǎn)功能完整的β細(xì)胞和胰島細(xì)胞，并且很快可以作為胰島素分泌細(xì)胞的資源來(lái)替代人的胰島。

圖-1 胰腺由外分泌和內(nèi)分泌區(qū)域組成。后者由稱(chēng)為朗格漢斯島(Inset)的小球樣微型器官組成。每個(gè)胰島都含有分泌胰島素的β細(xì)胞，以及其他分泌激素的內(nèi)分泌細(xì)胞(α、δ、epsilon和PP細(xì)胞)。所謂的“中心”細(xì)胞是β細(xì)胞的一個(gè)亞群，它協(xié)調(diào)胰島細(xì)胞在葡萄糖刺激后協(xié)同釋放胰島素。內(nèi)分泌細(xì)胞不是孤立存在的，而是存在于各種細(xì)胞組成的小生境中：包括基質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和血管周細(xì)胞。

盡管從人源胚胎干細(xì)胞制備胰島素分泌細(xì)胞取得了明顯的進(jìn)展，但完美地復(fù)制內(nèi)源β胰島細(xì)胞所有特點(diǎn)并實(shí)現(xiàn)其所有功能的細(xì)胞形成過(guò)程仍然有待闡明?？紤]到機(jī)體內(nèi)的β胰島細(xì)胞不是獨(dú)立存在的，而是處于錯(cuò)綜復(fù)雜的3D胰腺環(huán)境中，因此制備“完整”的胰島細(xì)胞應(yīng)當(dāng)有助于胰腺功能重建。事實(shí)上，β細(xì)胞功能的維持高度依賴(lài)于胰島復(fù)雜的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，而分離態(tài)的胰島細(xì)胞與完整結(jié)構(gòu)中的胰島細(xì)胞的行為不同。比如，由于基礎(chǔ)胰島素分泌量和葡萄糖刺激下最大胰島素分泌量下降，分離態(tài)的β細(xì)胞跟完整結(jié)構(gòu)狀態(tài)中的細(xì)胞相比，其葡萄糖刺激下的胰島素分泌功能低下。加之其它機(jī)制，像細(xì)胞-細(xì)胞信號(hào)交流的協(xié)調(diào)、細(xì)胞間隙連接蛋白Connexin-36等均在維持胰島素水平波動(dòng)中與β細(xì)胞聯(lián)結(jié)和胰島同步過(guò)程發(fā)揮重要作用。

考慮生產(chǎn)最理想效果的治療糖尿病治的人胚胎干細(xì)胞，所以制備細(xì)胞時(shí)必須考慮如何重建胰島細(xì)胞與細(xì)胞的接觸和胰島與微環(huán)境交流的結(jié)構(gòu)。

β細(xì)胞另外一個(gè)主導(dǎo)性功能是與胰島小生境中其它細(xì)胞的信息交流，包括多種非內(nèi)分泌型細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞。特別是，胰腺中胰島的血管高度發(fā)達(dá)，可能每一個(gè)β細(xì)胞都與內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生一個(gè)或多個(gè)接觸，并在接觸處形成特殊的超微結(jié)構(gòu)。在胰腺發(fā)育過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞最初被內(nèi)分泌細(xì)胞分泌的VEGF-A招募到迅速生長(zhǎng)的胰島。然后是內(nèi)皮細(xì)胞合成和分泌胰島膜基質(zhì)，并作為β細(xì)胞生長(zhǎng)、存活和功能的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。Otonkoski團(tuán)隊(duì)研究表明，人胰島中圍繞內(nèi)皮細(xì)胞和β細(xì)胞出現(xiàn)二個(gè)基膜。鑒于在自然環(huán)境中β細(xì)胞與支持細(xì)胞之間的特殊關(guān)系，在體外重塑內(nèi)源性β細(xì)胞小生境中某些元素可能促進(jìn)hESC衍生β細(xì)胞的存活和功能。

胰島血管小生境不僅包括內(nèi)皮細(xì)胞，還包括壁細(xì)胞，稱(chēng)為周細(xì)胞。周細(xì)胞包裹在內(nèi)皮細(xì)胞管周?chē)?，以提供結(jié)構(gòu)支持和產(chǎn)生成熟功能的血管并調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、存活和功能。周細(xì)胞在正常胰島功能中的作用還不完全清楚，而遺傳敲除研究則表明，成年鼠胰島中周細(xì)胞的缺失會(huì)導(dǎo)致胰島素表達(dá)和葡萄糖清除的障礙。

鑒于胰島細(xì)胞結(jié)構(gòu)對(duì)內(nèi)分泌功能的重要性，可以設(shè)計(jì)培養(yǎng)系統(tǒng)來(lái)再現(xiàn)發(fā)育過(guò)程中胰島復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的諸要素。各種方法被用于體外產(chǎn)生工程胰島，或所謂的‘假胰島’。多項(xiàng)研究報(bào)告表明，無(wú)論是在體外還是在體內(nèi)，移植了假胰島的再聚體之后，功能都得到了改善。也有證據(jù)表明，與僅由β細(xì)胞組成的假胰島相比，β細(xì)胞與內(nèi)皮祖細(xì)胞重新聚集在一起后，GSIS（葡萄糖刺激的胰島素分泌）得到了改善。

圖-2.webp.jpg圖-2 用人多能干細(xì)胞(hPSCs)生產(chǎn)β樣細(xì)胞涉及到促進(jìn)多能干細(xì)胞通過(guò)一系列中間祖細(xì)胞的階段。在完成定向分化后，可以被解離β樣細(xì)胞簇并重新聚集成確定大小和組成的胰島樣細(xì)胞團(tuán)。與其他類(lèi)型內(nèi)分泌細(xì)胞(它們本身可能來(lái)自hPSCs)的再聚集可能改善葡萄糖自我平衡功能，可能是通過(guò)某些hPSC衍生的β細(xì)胞向中心細(xì)胞的分化。最后，內(nèi)分泌細(xì)胞可以隨小生境細(xì)胞一起重新聚集，更緊密地再現(xiàn)對(duì)β細(xì)胞功能至關(guān)重要的局部微環(huán)境的相互作用。

總之，確定最適合人體胰島功能的細(xì)胞組成和結(jié)構(gòu)布局，仍需要做更多的工作?？赡艿奶魬?zhàn)包括確定如何獲得所需的人胰島小生境中的種子細(xì)胞，特別是考慮到某些細(xì)胞類(lèi)型缺乏真正具體的標(biāo)記，而且來(lái)源有限。一種選擇是從hESCs或誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(ipsCs)中產(chǎn)生這些細(xì)胞。另一個(gè)挑戰(zhàn)是，目前創(chuàng)建人工胰島的技術(shù)依賴(lài)于內(nèi)分泌細(xì)胞和非內(nèi)分泌細(xì)胞之間的自組織特性。也許有一天，胰島組織的3D打印或許成為可能，從而能夠完成所希望的結(jié)構(gòu)。

胰島細(xì)胞治療中存在的免疫問(wèn)題

最近使用β細(xì)胞替代治療T1D的成功，再加上hESC-或ipsC衍生β細(xì)胞的生產(chǎn)，為有效治療該疾病提供了路線(xiàn)圖。然而，免疫系統(tǒng)問(wèn)題仍然是廣泛采用細(xì)胞替代療法治療T1D和部分T2D患者的主要障礙。目前的免疫抑制劑是有效的，但需要終生治療，而且在許多情況下會(huì)產(chǎn)生副作用和毒性，因此多數(shù)采用這種治療策略時(shí)仍限于非常嚴(yán)重的病例。

1）首先是同種免疫排斥的問(wèn)題。

在T1D患者中，移植的異基因β細(xì)胞面臨同種免疫介導(dǎo)的排斥反應(yīng)，如果不被抑制，可以在幾天內(nèi)清除移植的細(xì)胞。T細(xì)胞是同種免疫的主要因素，其激活是由于T細(xì)胞受體(TCR)識(shí)別主要組織相容性復(fù)合物(MHCs)結(jié)合的抗原肽所致。MHC蛋白的高度多態(tài)性(在人類(lèi)中稱(chēng)為人類(lèi)白細(xì)胞抗原HLAs)是異基因免疫攻擊的主要靶點(diǎn)，次要組織相容性抗原，如女性受體中出現(xiàn)的男性抗原或線(xiàn)粒體抗原，盡管速度較慢，也能引起排斥反應(yīng)。

雖然免疫抑制保護(hù)移植物免受排斥，但廣泛的免疫抑制損害了患者的免疫系統(tǒng)，使他們?nèi)菀资艿礁腥竞蛺盒?/span>腫瘤的侵襲。一種理想的策略是訓(xùn)練免疫系統(tǒng)接受移植的細(xì)胞，避免慢性全身免疫抑制。許多臨床前動(dòng)物模型已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)移植組織的免疫耐受，目前，正在為人類(lèi)開(kāi)發(fā)潛在的耐受性療法。

在過(guò)去的20年中，人們一直在共同努力研究誘導(dǎo)移植耐受性的策略，其中策略之一就是：構(gòu)建供者-受體造血嵌合體。供體免疫細(xì)胞的存在，將培養(yǎng)受體免疫細(xì)胞接受供體來(lái)源的細(xì)胞作為自身細(xì)胞，從而防止移植排斥。這種方法的一個(gè)挑戰(zhàn)是混合嵌合狀態(tài)的不穩(wěn)定性，導(dǎo)致宿主或供體免疫系統(tǒng)失衡而被一方主導(dǎo)并接管。當(dāng)供體細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)時(shí)，移植物抗宿主病的風(fēng)險(xiǎn)就很高；當(dāng)受體細(xì)胞占上風(fēng)時(shí)，對(duì)供體的耐受性往往會(huì)喪失。另一種策略是：用過(guò)繼細(xì)胞療法促進(jìn)Tregs功能。過(guò)繼性Treg治療的一個(gè)挑戰(zhàn)是，大量的可對(duì)供體反應(yīng)的效應(yīng)T細(xì)胞可以壓倒Treg介導(dǎo)的抑制。用Tregs控制排斥反應(yīng)，需要減少受體體內(nèi)針對(duì)供體產(chǎn)生反應(yīng)的T細(xì)胞。不斷有新的臨床前結(jié)果表明，Treg細(xì)胞治療可以穩(wěn)定造血嵌合體，因此，這兩種療法有可能協(xié)同作用，以實(shí)現(xiàn)更可靠和持久的耐受性。

2）其次是自身免疫的問(wèn)題。

在T1D患者中，胰島自身抗原特異性T細(xì)胞也可以攻擊和破壞移植的β細(xì)胞，從而促使移植的β細(xì)胞被排斥?？刂芓1D患者自身免疫復(fù)發(fā)而排斥移植β細(xì)胞的策略，可以采取在研究控制T1D患者自身免疫中使用的措施。

已經(jīng)做了廣泛的研究工作使得T1D患者恢復(fù)自我免疫耐受。有趣的是，許多通常用來(lái)預(yù)防移植排斥的免疫抑制藥物并不能有效地誘導(dǎo)糖尿病的緩解。然而，大多數(shù)常用于預(yù)防同種免疫介導(dǎo)的移植排斥的免疫抑制藥物，都可導(dǎo)致短期糖尿病緩解，但沒(méi)有長(zhǎng)期療效。在免疫抑制的胰腺和腎移植受者中，傳統(tǒng)藥物用于抑制自身免疫反應(yīng)，也觀察到攻擊胰島細(xì)胞的自身免疫復(fù)發(fā)。T細(xì)胞和B細(xì)胞靶向治療，如抗CD3，Abatacept (類(lèi)似于上述的CTLA-4Ig分子)和抗CD-20，可使一些新的T1D患者的β細(xì)胞功能暫時(shí)停止下降?？剐叵偌?xì)胞球蛋白是一種在器官移植中常用于誘導(dǎo)T細(xì)胞衰竭的藥物，在高劑量時(shí)不能防止β細(xì)胞丟失，低劑量與G-CSF聯(lián)合使用時(shí)具有短期效益。相反，另一種T細(xì)胞靶向劑LFA-3Ig(Alefacept)能穩(wěn)定新發(fā)疾病患者的β細(xì)胞質(zhì)量。抗CD3、Abatacept和alefacept的共同之處在于，它們對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞具有相對(duì)的選擇性，同時(shí)保留甚至增強(qiáng)Tregs。因此，它們的治療效果可能是由于能夠在阻止效應(yīng)T細(xì)胞的同時(shí)促進(jìn)Treg的功能。這些在控制胰島自身免疫攻擊效果的提示，為設(shè)計(jì)更有效的聯(lián)合療法，以誘導(dǎo)長(zhǎng)期耐受性提供了指導(dǎo)。

表-1 用于同種免疫和自體免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)藥物。

除了上述廣泛的免疫調(diào)節(jié)策略外，也有研究持續(xù)努力地發(fā)展胰島抗原特異性治療方法。臨床前的數(shù)據(jù)表明，用胰島主要抗原制備的肽疫苗或納米微?？梢园邢蛴谔囟ǖ男?yīng)細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)免疫耐受，但這些策略在患者中的有效性仍有待臨床試驗(yàn)證明。雖然這些研究中有許多已經(jīng)在少數(shù)病人群體中顯示了一些效果，并且有幾個(gè)項(xiàng)目正在進(jìn)行新抗原治療的嘗試，但確定精確的抗原、時(shí)間和給藥方法是至關(guān)重要的，以期最大限度和有效地測(cè)試療效。抗原特異性免疫治療面臨的挑戰(zhàn)是免疫系統(tǒng)所針對(duì)的胰島抗原的數(shù)量；僅解除針對(duì)一種或一群胰島抗原特異性T細(xì)胞的殺傷功能不足以改變疾病的進(jìn)程。此外，在不同的患者、不同的疾病階段，胰島抗原的特異性可能是不同的，因此很難知道哪些特異胰島抗原才是目標(biāo)。誘導(dǎo)主要抗原特異的免疫調(diào)控的方法可能更有效，更容易應(yīng)用于不同的患者群體。

Treg細(xì)胞治療提供了許多有吸引力的特點(diǎn)，關(guān)乎效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)主要抗原特異性反應(yīng)的調(diào)節(jié)。例如，Tregs通過(guò)‘關(guān)聯(lián)抑制’和‘傳染性耐受’來(lái)控制不希望的免疫反應(yīng)。在關(guān)聯(lián)抑制中，由一個(gè)抗原激活的Tregs可以抑制在同一組織微環(huán)境中出現(xiàn)的針對(duì)其它抗原的反應(yīng)。在傳染性耐受中，Tregs創(chuàng)造了一個(gè)耐受性組織微環(huán)境，從而使附近其它的激活T細(xì)胞采取調(diào)節(jié)而不是效應(yīng)命運(yùn)。這使得Tregs的抑制性能夠隨著時(shí)間的推移而傳播，而不僅僅局限于起始細(xì)胞的存在。這些特性確保特異性有限的Tregs能夠?qū)植科渌庖呒?xì)胞進(jìn)行特異、顯著和持久的控制。的確，單次注射胰島抗原特異性Tregs可誘導(dǎo)自身免疫性非肥胖糖尿病小鼠糖尿病終生的緩解。目前，Treg細(xì)胞治療T1D患者的早期試驗(yàn)正在進(jìn)行中，顯示了這種方法在患者中的可行性和安全性。

干細(xì)胞微囊化的未來(lái)方向與策略

干細(xì)胞可改善和治療諸多疾病是不爭(zhēng)的事實(shí)。本文前面對(duì)干細(xì)胞來(lái)源胰島細(xì)胞的生產(chǎn)和面臨的免疫障礙進(jìn)行了介紹，而實(shí)際面臨的進(jìn)展和挑戰(zhàn)要更麻煩。比如，臨床上，胰島移植的技術(shù)越來(lái)越成熟，對(duì)移植位置和血供等等的研究使得胰島移植成為治療的金標(biāo)準(zhǔn)；患者健康狀況也需考慮，以保證臨床治療手段可得到滿(mǎn)意的臨床療效。

由于干細(xì)胞生產(chǎn)的β細(xì)胞越來(lái)越接近內(nèi)源性細(xì)胞的特點(diǎn)，使之臨床應(yīng)用越來(lái)越靠譜，然而，免疫排斥的困難仍不容小覷。用基因編輯的方法來(lái)剔除免疫相關(guān)基因來(lái)減低免疫排斥或提升免疫耐受，但是，由于細(xì)胞復(fù)雜、相互關(guān)聯(lián)和制約的關(guān)系，容易造成免疫系統(tǒng)失衡，仍需要深入和謹(jǐn)慎的考量和抉擇。

采用組織工程的方法把胰島素分泌細(xì)胞包裹到特殊材料的微型膠囊裝置里，一方面可以提供胰島素分泌細(xì)胞，另一方面可以限制免疫細(xì)胞的攻擊。雖然實(shí)際操作過(guò)程中，也面臨了諸多的復(fù)雜問(wèn)題，尤其是技術(shù)實(shí)現(xiàn)手段的問(wèn)題，但仍有臨床實(shí)驗(yàn)產(chǎn)品的推出。因此，前景依然看好。

干細(xì)胞微囊化已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。2014年，第一例基于ESC治療1型糖尿病產(chǎn)品的進(jìn)入臨床試驗(yàn)（NCT02239354），命名為VC？01（ViaCyt公司），是hESC衍生的胰腺內(nèi)胚層細(xì)胞（稱(chēng)為PEC？01細(xì)胞），是一種皮下注射植入式半滲透釋藥裝置，可以免疫隔離，允許氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)。這是一項(xiàng)開(kāi)放性的1/2期臨床試驗(yàn)，評(píng)估了糖尿病治療候選藥物PEC-Encap 的安全性、耐受性以及療效。還有另一個(gè)臨床試驗(yàn)（NCT01652911），這產(chǎn)品不能進(jìn)行免疫隔離，將其植入皮膚下血管處30天后，隨后再植入胰島細(xì)胞。這項(xiàng)為期3年的臨床試驗(yàn)在招募了3個(gè)患者之后中終止了。

總的來(lái)說(shuō)，相關(guān)學(xué)科快速的進(jìn)展，為糖尿病患者治療提供了新的可期待的治療途徑。盡管這些領(lǐng)域仍有不小的技術(shù)障礙，但新的膠囊技術(shù)、新的免疫調(diào)節(jié)方法、干細(xì)胞分化方法的改進(jìn)和基因編輯手段的結(jié)合應(yīng)用，新技術(shù)將給T1D和T2D患者帶來(lái)了革命性的現(xiàn)代細(xì)胞治療方法。